Cốt truyện của trò chơi này xoay quanh cuộc đời của sát thủ lão làng Ezio. Lúc này, ông đã ở tuổi ngoại ngũ tuần, cũng là lúc để suy ngẫm về cuộc đời mình.Câu hỏi lớn đặt ra cho Ezio đó là việc ông trở thành sát thủ chỉ là một sự tình cờ ngẫu nhiên hay là định mệnh mà số phận đã an bài? Liệu rằng trước đây nếu không gặp phải thảm kịch tan cửa nát nhà, cuộc đời ông sẽ trôi nổi về đâu? Vậy là Ezio lên đường tìm kiếm sứ mệnh lớn của đời mình bằng việc thu thập đủ 5 miếng phong ấn mở ra kho tàng kiến thức của tổ tiên thời Altair.
Quá trình người chơi khám phá thế giới cũng là quá trình tìm ra những bí ẩn còn giấu kín bên trong con người nhân vật chính. Mỗi phong ấn như một miếng ghép bị thiếu trong cuộc đời Altair, nó giúp cho Ezio có khả năng đi ngược dòng thời gian giống như thiết bị Animus đã làm với Desmond vậy. Nói một cách đơn giản đó là bạn sẽ điều khiển Altair thông qua ý nghĩ của Ezio và điều khiển Ezio thông qua ý nghĩ của Desmond.
Rời khỏi nước Ý, Ezio chu du tới xứ sở xa lạ vùng Trung Đông – nơi khởi nguồn của tất cả và cũng chính là đại bản doanh của hội sát thủ Assassins Order trước đây. Người chơi sẽ được thám hiểm những thành phố lớn như Masyaf, Cappadocia, Constantinople … và gặp gỡ nhiều nhân vật mới như sát thủ Yusuf Tazim, hoàng thân Ahmet và hoàng tử Suleiman – những con người có thật và ảnh hưởng lớn đến lịch sử loài người.
Để hoàn thành sứ mệnh của mình, Ezio sẽ có thêm hỗ trợ từ những công cụ “tân tiến”. Đầu tiên có thể kể đến là thanh Hiddenblade, một thanh kiếm nhỏ dắt trong tay áo mà chúng ta có lẽ đã quá quen thuộc với nó từ thời đại xa xưa của Altair rồi.
Ezio bị vây hãm giữa vòng vây kẻ thù và cây Hiddenblade bị đánh gãy. Sau này, ông gặp được người bạn “đồng nghiệp” Yusuf và cũng chính là người chế tạo cho ông một thanh hookblade mới, tiện dụng và đa năng hơn rất nhiều.
